Современные методы разделения белков на фракции. Разделение белков по размерам с использованием DDC-Na
Лабораторная работа №8
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ РАЗДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ
Метод основан на том, что молекулы белка обладают электрическим зарядом, величина и знак которого определяются аминокислотным составом белка, pH и ионной силой окружающей среды. Под влиянием внешнего электрического поля заряженные молекулы передвигаются в растворе к противоположно заряженному полюсу. Скорость перемещения белковых частиц пропорциональна величине их заряда и обратно пропорциональна размеру частиц и степени их гидратации.
Широкое распространение в настоящее время получил так называемый «зональный электрофорез» - электрофорез на твердом носителе (на бумажных полосах, агаре, крахмале, акриламиде), пропитанном буферным раствором с нужным значением pH. Положение белков на бумаге или геле определяют путем фиксации и последующего окрашивания их тем или иным красителем (обычно бромфеноловым синим, амидовым черным или кумасси синим). Количество белка в каждой фракции можно ориентировочно определять по интенсивности окраски связанного красителя. Такое определение не дает строго количественного соотношения белковых фракций, так как количество красителя, связываемого различными белками, неодинаково.
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ HA БУМАГЕ
Разделение анализируемой смеси происходит на определенных сортах хроматографической бумаги, пропитанной буферным раствором, в приборах для электрофореза. Белки разделяют при напряжении до 500 B.
Камера для электрофореза состоит из плексигласовой ванны и пригнанной к ней крышкой (1). B ванне имеются 2 электродных отсека (2), каждый из которых разделен продольной перегородкой (3) на два отделения, сообщающиеся между собой. Bo внутренние отделения отсеков опускают электроды, а во внешние - концы бумажных полос (4), основную часть которых располагают на горизонтальной пластинке с шипами (5), находящейся в центральной части камеры. Между горизонтальной пластинкой и наружным отделением электродных отсеков имеются палочки (6),
Рис.2. Схема прибора для низковольтного электрофореза
через которые перекидываются бумажные полоски и которые служат для их поддерживания. Под верхней крышкой камеры находится сделанная из плексигласа пластинка с большими круглыми отверстиями (7), на которую сверху кладутся смоченные в дистиллированнон воде, сложенные в 4 - 5 раз листы фильтровальной бумаги. Эти листы способствуют увеличению герметичности камеры и, как следствие, - уменьшению испарения жидкости с электрофореграмм в процессе электрофореза.
Электрофорезом на бумаге студентам предлагается провести разделение белков сыворотки крови. Этим методом сыворотку крови можно разделить на 5 - 9 фракций и определить относительное содержание белка в каждой из них. Разделение проводят в буферном растворе (pH 8,6 - 8,9) при градиенте потенциала 3 - 5 В/см (120 - 350 B для полос длиной 40 - 45 см) при комнатной температуре. Сила тока не должна превышать 0,1 - 0,3 мА на каждый сантиметр поперечного сечения бумажной полосы. Увеличение силы тока более чем в 2 раза недопустимо, так как при этом происходит чрезмерное нагревание, значительное увеличение испарения и в конечном итоге - прогорание бумаги
Реактивы:
1. Буферный раствор. Можно использовать:
а) веронал-мединаловый буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют10,32 гмединала (натриевая соль веронала), добавляют1,84 гверонала, нагревают при помешивании на водяной бане до растворения и доводят водой до1 л;
б) веронал-ацетатный буфер (pH 8,6): в 300 мл дистиллированной воды растворяют4,3 гверонала,0,95 гедкого натра и3,24 гуксуснокислого натрия. K раствору приливают 30 мл0,1 Mраствора HCl и доводят водой до1 л;
в) трис-буфер (pH 8,9): в1 лдистиллированной воды растворяют60,5 гтриса,6 гэтилендиаминтетрауксусной и4,6 гборной кислоты.
2. Растворы для окраски электрофореграмм:
а) кислый сине-черный краситель (аналогичный амидовому черному 10 Б) -0,2 гв смеси: уксусная кислота (ледяная) - 100 мл + метиловый спирт - 900 мл;
б) бромфеноловый синий -0,5 г, сулема -10 г, уксусная кислота (ледяная) - 20 мл, дистиллированная вода - 980 мл;
в) бромфеноловый синий - 0,1 г, ZnSO 4 ·7H 2 O -50 г, уксусная кислота (ледяная) 50 мл, дистиллированная вода - 900 мл.
3. Растворы для отмывания электрофореграмм от несвязавшейся с белком краски и закрепления красителя на белке:
а) уксусная кислота - 2 %-й раствор;
б) уксуснокислый натрий - 2 %-й раствор, приготовленный на 10 %-м растворе уксусной кислоты.
4. Растворы для элюции окрашенных продуктов с электрофореграмм:
а) для извлечения бромфенолового синего -0,01 Mраствор NaOH;
б) для извлечения кислого сине-черного красителя -0,1 Mраствор NaOH.
Оборудование: пробирки; кюветы, спектрофотометр, прибор для электрофореза, бумага хроматографическая: FN4, FN5, ватман 3, ватман 3MM и др.
Получение сыворотки крови. 2 - 3 мл крови набирают в сухую центрифужную пробирку и оставляют на 1/2 - 1 ч. Тонкой стеклянной палочкой осторожно обводят стенки пробирки для отделения от них сгустка, центрифугируют и сыворотку сливают в чистую пробирку.
Подготовка камеры. Отсеки для электродов наполняют буферным раствором до одинакового уровня (во избежание перетекания буфера), примерно по 800 мл в каждый отсек. Bo внутренние части электродных отсеков погружают электроды. Ha листе хроматографической бумаги (18x45 см) (при использовании тонких сортов бумаги образцы лучше наносить на отдельные полоски шириной 4 -5 см) на расстоянии15 см от одного из его узких сторон простым мягким карандашом (графит препятствует растеканию жидкости) очерчивают места для нанесения проб. Они представляют собой прямоугольники (2 х0,3 см), большие стороны которых располагают перпендикулярно длине бумажной полосы. Расстояние между стартовыми зонами и краями электрофореграммы -2 см. Электрофореграмму пропитывают буфером, в котором будет проходить электрофорез. Для этого ее протягивают через кювету с буферным раствором. Концы бумажных полос (6 -8 см) не смачивают. От избытка буфера освобождаются, промокая полосы между двумя-тремя листами фильтровальной бумаги. Влажную электрофореграмму помещают в камеру на центральную горизонтальную пластинку (5), а концы опускают в наружные отделения электродных отсеков Прибор плотно закрывают крышкой, под которой находятся смоченные водой листы фильтровальной бумаги.
Проведение электрофореза. После того как бумажные полосы полностью пропитаются буферным раствором, на отмеченные участки с помощью пипетки объемом 0,1 мл наносят пробы: 0,01 - 0,02 мл (1 - 2 мг белка) сыворотки. Камеру закрывают крышкой и включают ток. Длительность электрофореза составляет 22 - 24 ч при напряжении 200 - 300 B
Фиксация и окраска электрофореграмм. По окончании электрофореза выключают ток и тотчас вынимают электрофореграммы из прибора. Их располагают на специальной подставке и подсушивают на воздухе под тягой, затем - в сушильном шкафу при 105 ºC в течение 20 мин для фиксации белков на бумаге, после чего помещают в эмалированную кювету, заливают красителем и оставляют на 2 - 3 ч и более. Краситель сливают и электрофореграммы отмывают от его избытка, заливая 3 - 4 раза 2 %-м раствором уксусной кислоты, каждый раз на 5 - 10 мин. Участки бумаги, не содержащие белка, должны быть полностью освобождены от красителя. Для закрепления окрашенных продуктов электрофореграммы на 2 мин заливают 2 %-м раствором уксуснокислого натрия и сушат на воздухе под тягой.
Определение соотношения отдельных фракций белка. При pH 8,6 белки сыворотки крови заряжены отрицательно и перемещаются в электрическом поле к аноду. Быстрее всего к аноду движется фракция, альбуминов, затем идут α 1 -, α 2 -, β- и γ-глобулины (см. Рис. 3). Участки бумажных лент, на которых проявились пятна белков, делят поперечными линиями простым карандашом на полоски шириной в 3 -5 мм и разрезают no этим линиям. Каждую полоску измельчают и помещают в отдельную пронумерованную пробирку, заливают 3 мл0,01 M раствора NaOH, оставляют на час для извлечения краски из бумаги, а затем находят для каждого раствора значение оптической плотности на фотоколориметре (спектрофотометре) при 612 нм.
Рис. 3. Электрофореграмма сыворотки крови человека и кривая распределения белковых фракций
Параллельно обрабатывают контрольную пробу. Для нее вырезают полоску из неокрашенных участков электрофореграммы.
Ha основании полученных данных строят кривую распределения окрашенных продуктов на электрофореграмме Ha оси абсцисс отмечают номера пробирок, на оси ординат - соответствующее значение оптической плотности (см. Рис.3). Рассчитывают процентное соотношение белковых фракций в сыворотке крови. Для этого вычерченную кривую делят по минимумам на ряд участков, соответствующих отдельным фракциям. Величина площади каждого участка пропорциональна количеству краски, соединившейся с белком данной фракции. Соотношение между этими площадями вычисляют по весу (вес участков бумаги пропорционален их площади), всю площадь принимают за 100 %. При наличии денситометра соотношение белковых фракций в сыворотке крови можно определить из денситограммы.
Предварительно определяя содержание белка в сыворотке, рассчитывают его количество для каждой фракции.
Отделение белков от низкомолекулярных примесей
Метод мембранных сит (диализ)
Используют диализную мембрану, которая является полимером и имеет поры определенной величины. Малые молекулы (низкомолекулярные примеси) проходят через поры в мембране, а крупные (белки) задерживаются. Таким образом белки отмывают от примесей.
Разделение белков по молекулярной массе
Гель-хроматография
Хроматографическую колонку заполняют гранулами геля (сефадекс), который имеет поры определенной величины. В колонку вносят смесь белков. Белки, размер которых меньше, чем размер пор сефадекса, задерживаются в колонке, так как «застревают» в порах, а остальные свободно выходят из колонки. Размер белка зависит от его молекулярной массы.
Ультрацентрифугирование
Этот метод основан на различной скорости седиментации (осаждения) белковых молекул в растворах с различным градиентом плотности (сахарозный буфер или хлорид цезия).
Электрофорез
Данный метод основан на различной скорости миграции белков и пептидов в электрическом поле в зависимости от заряда.
Носителями для электрофореза могут служить гели, ацетатцеллюлоза, агар. Разделяемые молекулы движутся в геле в зависимости от размера: те из них, которые имеют большие размеры, будут задерживаться при прохождении через поры геля. Меньшие молекулы будут встречать меньшее сопротивление и, соответственно, двигаться быстрее. В результате, после проведения электрофореза, большие молекулы будут находиться ближе к старту, чем меньшие.
Методом электрофореза можно разделить белки по молекулярной массе. Для этого используют электрофорез в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия (ДДS-Na).
ДДС-Na является дифильным веществом и содержит заряженную группу и гидрофобную. Белки связываются с ДДС-Na своими гидрофобными радикалами и при этом денатурируют. Таким образом, белки выравниваются по форме и заряду. После этого подвижность белка при электрофорезе зависит только от его молекулярной массы.
Исследование однородности белковых препаратов и выделение отдельных белковых фракций производится с помощью различных методов, наиболее важные из которых основаны на применении ультрацентрифугирования, электрофореза, хроматографии, а также на изучении растворимости белков.
1. Методы разделения белков и аминокислот, основанные на различиях веществ в молекулярной массе:
а) ультрацентрифугирование. В ультрацентрифуге сначала осаждаются более тяжелые молекулы, затем менее тяжелые.
б) гель-фильтрация. При этом методе хроматографическая колонка заполняется пористыми гранулами сильно гидратированного углеводного полимера, чаще всего сефадекса (специальным образом обработанные производные высокомолекулярного углевода декстрана). При фильтровании через такую колонку смеси низкомолекулярных и высокомолекулярных белков небольшие белковые молекулы, проникая через поры внутрь гранул сефадекса, будут протекать по колонке медленнее, чем белки, молекулы которых не помещаются в порах гранул и поэтому быстрее вытекают из колонки.
2. Методы разделения белков и аминокислот, основанные на различиях в их кислотно-основных свойствах (или различия их электрических зарядов):
а) метод электрофореза. Смысл электрофореза заключается в разделении находящихся в растворе веществ в электрическом поле на основе различий их электрических зарядов. Электрофоретическое исследование белка производят обычно при нескольких значениях рН, т.к. установлено, что если при одном рН препарат белка ведет себя как однородное вещество, то при другом рН этот же препарат может быть неоднородным.
За последние годы широкое распространение получил электрофорез растворов белков и пептидов на различных носителях – фильтровальной бумаге, целлюлозном или крахмальном порошке, полиакриламидном геле. Эти методы позволяют анализировать чрезвычайно малые количества белков.
б) диск-электрофорез в полиакриламидном геле, при котором смесь белков подвергается одновременному воздействию электрического поля и градиента рН. Он обладает особенно высокой разрешающей способностью.
Фильтрование через гель, так же как и электрофорез в полиакриламидном геле, широко применяется для быстрого приблизительного определения молекулярной массы белков.
в) ионообменная хроматография. В ионообменной хроматографии в качестве носителя используются полимеры, несущие на себе заряд – ионообменные смолы:
· катионообменные смолы (заряженные отрицательно) – обмениваются катионами;
· анионообменные смолы (заряженные положительно) – обмениваются анионами.
Например, часто используется катионообменная полистероидная сульфированная смола. Если раствор аминокислот имеет кислую среду, при загрузке колонки положительно заряженные аминокислоты и белки вытесняют натрий и соединяются с сульфид-анионом. При добавлении гидрооксида натрия рН увеличивается; когда рН достигнет значения, равного изоэлектрической точке молекулы белка, аминокислоты теряют заряд и становятся нейтральными. Под действием силы тяжести аминокислота выходит из колонки, потеряв заряд. Разные белки (аминокислоты) имеют разные значения изоэлектрических точек.
3. Методы разделения, основанные на различиях в веществ по растворимости:
а) метод фракционирования белков солевыми растворами. Основан на том, что каждый индивидуальный белок разделяемой смеси осаждается из нее при определенной концентрации той или иной соли, в то время как другие белки при данной концентрации соли остаются в растворе. Процесс осаждения белка из раствора под действием соли называется высаливанием. При дальнейшем насыщении солью выпадает следующий индивидуальный белок и, таким образом, можно один за другим выделить относительно чистые индивидуальные белки.
б) распределительная хроматография на бумаге. Этот метод основан на различной степени распределения компонентов смеси между двумя несмешивающимися жидкими фазами (подвижной и неподвижной) и заключается в том, что каплю гидролизата белка наносят на полоску хроматографической бумаги, один конец которой опускают в органический растворитель. Растворитель под действием капиллярных сил всасывается бумагой и, проходя по полоске бумаги, увлекает за собой аминокислоты.
Скорость перемещения аминокислот по бумаге зависит от их химического строения и способности растворяться в подвижном и неподвижном растворителях. В качестве подвижного растворителя используют водонасыщенный фенол, n-бутиловый спирт и др. Неподвижным растворителем является вода, пары которой насыщают бумагу. Чем меньше растворимость аминокислот в воде и чем больше их растворимость, например, в феноле, тем быстрее они движутся вслед за фронтом органического растворителя.
4. Определение первичной структуры белка
Наиболее ответственной процедурой при установлении первичной структуры белков является определение последовательности аминокислотных остатков. В настоящее время эту работу ведут преимущественно либо фенилизотиоцианатным методом Эдмана.
Метод Эдмана реализуется в специально созданном для этой цели приборе, получившем название секвенатор (от sequence – последовательность). Метод Эдмана сводится к обработке фенилизотиоцианатом белка или пептида, присоединенного через С-концевую аминокислоту к инертному носителю (полистиролу или пористому стеклу) в колонке секвенатора. После промывки колонки растворителями (метанол, дихлорэтан) образовавшийся фенилтиокарбамилпептид подвергают воздействию безводной трифторуксусной кислоты, в результате чего высвобождается анилинотиозолинон и в его составе N-концевая аминокислота, а укороченный на один аминокислотный остаток пептид или белок остается связанным с носителем.
Раздел 3. НУКЛЕОТИДЫ И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ
Лекция 4. Строение и функции нуклеотидов
1. Общая характеристика нуклеотидов
Нуклеотиды – сложные органические вещества, состоящие из 3-х обязательных компонентов:
1) азотистого основания;
2) пятиуглеродного сахара;
3) остатка фосфорной кислоты.
Сложные органические соединения, состоящие только из азотистого основания и сахара-пентозы, называются нуклеозидами. Следовательно, нуклеотиды – фосфорнокислые эфиры нуклеозидов.
Азотистые основания
Азотистые основания являются производными двух гетероциклических соединений – пурина и пиримидина:
· пуриновые азотистые основания:
Аденин Гуанин
· пиримидиновые азотистые основания:
Урацил Цитозин Тимин
Пятиуглеродные сахара:
β-рибоза β-дезоксирибоза
Фосфорная кислота
В состав нуклеотидов обязательно входит остаток фосфорной (ортофосфорной) кислоты.
Помимо указанных выше трех обязательных компонентов, в состав молекул нуклеотидов могут входит и другие функциональные группы.
При образовании нуклеозидов первый атом рибозы (дезоксирибозы) связывается с N-1 атомом пиримидинового или N-9 атомом пуринового основания.
С рибозой соединяются аденин, образуя аденозин; гуанин, образуя гуанозин; цитозин, образуя цитидин; урацил, образуя уридин.
С дезоксирибозой соединяются аденин, гуанин, цитозин и тимин, образуя соответственно дезоксиаденозин, дезоксигуанозин, дезоксицитидин, тимидин.
Наиболее распространено в природе присоединение по 5 положению сахара и оно не указывается.
В организме нуклеотиды являются мономерами нуклеиновых кислот, либо функционируют самостоятельно. В зависимости от того, в каком количестве в нуклеотидах представлены их основные компоненты, все нуклеотиды подразделяют на мононуклеотиды, динуклеотиды и полинуклеотиды (полинуклеиновые кислоты).
2. Строение и функции моно- и динуклеотидов
Моно- и динуклеотиды не входят в состав нуклеиновых кислот; они функционируют самостоятельно. В состав самостоятельных нуклеотидов в качестве сахара всегда входит рибоза.
К мононуклеотидам относятся АТФ, АДФ, АМФ, коэнзим А и другие нуклеотиды.
АТФ – аденозинтрифосфорная кислота:
АТФ – энергетический эквивалент клетки, она является посредником между реакциями, идущими с выделением энергии (экзергоническими) и реакциями, идущими с поглощением энергии (эндергоническими). Иными словами, в форме АТФ клеткой запасается энергия, которая затем используется для процессов жизнедеятельности.
Химические связи между различными атомами в органических соединениях делятся на 2 типа:
1) нормальные
2) макроэргические
Нормальные связи – связи, при возникновении или распаде которых изменение уровня свободной энергии соединений составляет 12,5 Дж/моль.
Макроэргические связи – связи, при возникновении или распаде которых уровень свободной энергии соединения составляет 25-50 кДж/моль вещества.
Понятие «макроэргическая связь» учитывает энергетический эффект преобразованной связи посредством химической реакции вещества с нормальными свойствами.
Связи между остатками фосфорной кислоты являются макроэргическими – при их гидролизе выделяется энергия. Такие связи принято обозначать волнистой черточкой.
Энергия 1-й молекулы АТФ может служить только для 1-й реакции. АДФ и АМФ – не способны быть источником энергии.
В живых клетках имеются 3 способа образования АТФ:
1) Субстратное фосфорилирование.
2) Окислительное фосфорилирование.
3) Фотосинтетическое фосфорилирование.
Коэнзим А (КоА) . КоА является переносчиком ацильных групп; участвует во многих процессах. В его состав входит аденин, рибоза, пирофосфат, пантотеновая кислота (витамин В 3) и тиоламин. Упрощенно коэнзим А представляют в виде следующей формулы: HS-KoA. При взаимодействии коэнзима А с уксусной кислотой образуется ацетилкоэнзим А, в молекуле которого появляется макроэргическая (высокоэнергетическая):
Ацетилкоэнзим А
Ацетилкоэнзим А является ключевым метаболитом, благодаря которому осуществляется не только распад и синтез различных веществ, но и взаимосвязь между процессами обмена белков, липидов и углеводов.
К динуклеотидам относятся НАД, НАДФ, ФАД и др.
НАД – никотинамидадениндинуклеотид;
НАДФ – никотинамидаденин динуклеотид фосфат.
В состав этих динуклеотидов входит никотинамид (амид никотиновой кислоты, являющееся важным витамином - витамином В 5). Молекула НАДФ идентична по структуре НАД с той лишь разницей, что у НАДФ у С-3 атома рибозы ОН-группа замещена остатком молекулы фосфорной кислоты.
Молекулы НАД и НФДФ способны к обратимому окислению и восстановлению (благодаря окислительно-восстановительной способности никотинамида), поэтому они участвуют в качестве переносчиков водорода; в реакциях биологического окисления НАД и НАДФ являются кофакторами ферментов дегидрогеназ.
Структура НАД (окисленная форма)
ФАД – флавинадениндинуклеотид. В его состав входит рибофлавин (витамин В 2).
Структура ФАД (окисленная форма)
ФАД, как и другие динуклеотиды, способен обратимо окисляться и восстанавливаться, присоединяя к своей молекуле 2 атома водорода, поэтому он участвует в биологическом окислении в качестве переносчика водорода. Является кофактором дегидрогеназ, так же, как и НАД и НАДФ.
3. Строение и функции нуклеиновых кислот
Самое замечательное свойство живых клеток – их способность воспроизводить себе подобных с почти предельной точностью и не один-два раза, а в сотнях и тысячах генераций.
Живые клетки обладают такой способностью благодаря наличию в них нуклеиновых кислот.
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота;
РНК – рибонуклеиновая кислота.
ДНК и РНК – высокомолекулярные соединения, которые построены на основе нуклеотидов, соединенных 3, 5 - фосфодиэфирными связями. Их молекулярная масса сильно варьирует (от 15 тыс. до 1 млрд).
Нуклеиновые кислоты хорошо растворяются в фенолах; плохо – в слабых растворах кислот.
Различия между ДНК и РНК:
1. В составе ДНК – аденин, гуанин, цитозин, тимин;
в составе РНК – аденин, гуанин, цитозин, урацил.
2. В составе ДНК – дезоксирибоза; в составе РНК – рибоза.
3. Молекулы ДНК двухцепочечные; РНК – одноцепочечные.
Особенности структуры ДНК
· ДНК состоит из двух правозакрученных полинуклеотидных спиралей, имеющих общую ось.
· Две цепи ДНК антипараллельны, т.е. 3 и 5 фосфодиэфирные мостики ориентированы в противоположных направлениях.
· Основания плоские, гидрофобные, расположены в параллельных плоскостях и перпендикулярно длинной оси спиралей.
· Основания 2-х цепей спарены. Напротив А-Т; напротив Г-Ц;
Спаренные основания являются комплементарными по отношению друг к другу.
Комплементарность – пространственная взаимодополняемость поверхностей взаимодействующих молекул или их частей, приводящая к возникновению между ними вторичных связей.
Между А и Т возникает 2 водородные связи; между Г и Ц – 3 водородные связи.
Остатки сахаров и фосфорные группы остаются на поверхности молекулы и контактируют с водой. Отрицательно заряженные группы остатков фосфорной кислоты легко вступают во взаимодействие с белками, среди которых преобладают гистоны – белки, отличающиеся своей основной природой.
4. Нуклеиновые кислоты отличаются друг от друга по функциям.
Функции ДНК – хранение, репликация (удвоение) и передача наследственной информации (наследственная информация – это информация о первичной структуре белков).
Функции РНК определяются типом РНК.
Типы РНК:
а) м-РНК – матричная или и-РНК – информационная.
Матричная РНК выполняет функцию переноса наследственной информации из ядра клетки от ДНК в цитоплазму, к месту синтеза белка.
Реализация наследственной информации – синтез белка.
Существуют сотни тысяч видов м-РНК в клетке.
б) т-РНК – транспортная.
Переносит к месту синтеза белка необходимые аминокислоты.
в) р-РНК – рибосомальная.
Рибосомы – органоиды, выполняющие функции синтеза белка.
5. Нуклеиновые кислоты отличаются по локализации.
Основное количество ДНК находится в ядре клетки (в составе хромосом). Часть ДНК располагается в митохондриях и хлоропластах (ее называют цитоплазматической ДНК). РНК находится в цитоплазме.
4. Основные биохимические функции нуклеотидов
Таким образом, нуклеотиды объединяют группу веществ, которые выполняют самые разнообразные функции:
1. Являются строительными блоками нуклеиновых кислот, участвуют в молекулярных механизмах, с помощью которых генетическая информация хранится, реплицируется и транскрибируется.
2. Выполняют важную роль в энергетическом (фосфорном) обмене, в аккумулировании и переносе энергии.
3. Служат кофакторами ферментов, относящихся к различным классам.
4. Играют важную роль в синтезе и распаде углеводов, жирных кислот и липидов.
5. Некоторые нуклеотиды являются посредниками в сложных процессах сигнальной трансдукции (передачи сигналов в живых клетках).
Раздел 4. ФЕРМЕНТЫ
Лекция 5. Строение, механизм действия и классификация ферментов
1. Строение и основные свойства ферментов
Ферменты (энзимы) – вещества белковой природы, присутствующие во всех живых клетках и выполняющие роль катализаторов биохимических процессов.
По своему составу ферменты делятся на:
1) простые – состоят только из аминокислот;
2) сложные – состоят из 2-х частей:
Из белковой, которая называется апоферментом и
Небелковой части – кофактора.
Комплекс апофермента и кофактора называется холоферментом.
Ни апофермент, ни кофактор по отдельности не способны катализировать реакцию. Функционально активен только их комплекс.
Виды кофакторов:
По своей химической природе кофакторы могут быть представлены как органическими, так и неорганическими соединениями.
Органические кофакторы можно разделить на две группы:
1) простетические группы – кофакторы, которые прочно соединены с апоферментом и при выделении из организма не отсоединяются от белковой части.
Например, ФАД в составе фермента сукцинатдегидрогеназы из цикла Кребса.
2) коферменты – кофакторы, которые соединены с апоферментами слабыми связями и легко от него отщепляются: например, НАД, НАДФ, а иногда и ФАД.
Неорганические кофакторы представлены ионами металлов (чаще всего ионами железа, меди, марганца, цинка и т.д.). Ионы металлов как кофакторы либо непосредственно участвуют в акте катализа, либо образуют мостики, связывающие фермент с субстратом.
Субстрат (S) – вещество, химические превращения которого катализирует фермент.
Строение фермента, или энзима (Е):
Поскольку молекулы субстрата обычно мельче молекул ферментов, то в непосредственный контакт с субстратом вступает только часть молекулы фермента – активный центр. Причем, геометрическая форма поверхности участка молекулы субстрата является комплементарной поверхности активного центра.
Активный центр фермента – уникальная комбинация аминокислотных остатков, обеспечивающая взаимодействие с молекулой субстрата и участвующая в акте катализа. У сложных ферментов в состав активного центра обязательно входит кофактор.
Активный центр может иметь 2 участка:
· якорный (субстратный);
· каталитический.
Якорный участок обладает геометрическим сходством (соответствием) молекулы субстрата и обеспечивает специфичность действия фермента.
Сходство между ферментами и небиологическими катализаторами
1. Любой катализатор (неорганический и органический) уменьшает энергию активации молекулы. Энергия активации – количество энергии в калориях, необходимая для перевода всех молекул 1-го моля вещества в активированное состояние, т.е. состояние, при котором они способны вступить в химическую реакцию.
2. Любой катализатор может ускорять только химические реакции, возможные с точки зрения термодинамики.
3. Катализаторы не изменяют направление химической реакции.
4. Катализаторы не расходуются в процессе реакции.
Отличия ферментов от неорганических катализаторов
1. Катализ осуществляется в очень мягких условиях (Т, рН)
2. Высокая эффективность: ферменты увеличивают скорость реакции
в 10 10 - 10 12 раз.
Пример: в организме есть фермент каталаза (кофактор - Fe).
1 мг железа в каталазе действует как 10 т неорганического железа.
3. Специфичность действия. Каждый фермент ускоряет только 1 реакцию. Виды специфичности:
Абсолютная (1 фермент действует только на 1 субстрат, например, фермент уреаза катализирует гидролиз мочевины);
Относительная (1 фермент может действовать на группу сходных по строению субстратов).
4. Возможность тонкой и точной регуляции скорости реакции изменением условий среды (связано с белковой природой фермента)
Для каждого фермента есть свой температурный оптимум.
Пример: температура тела – 36,6 град.; при Т=40-41град. может быть необратимая денатурация. При низких температурах наблюдается снижение скорости ферментативного катализа (из-за броуновского движения молекул).
Ферменты очень чувствительны к изменению кислотности среды, в которой они действуют. Активность фермента проявляется в пределах довольно узкой зоны рН, называемой оптимумом рН. Можно считать, что для каждого фермента имеется определенная оптимальная концентрация протонов, при которой он наиболее активен.
Изменение рН приводит к изменению зарядов на активном центре и на молекуле в целом; в результате этого изменяется конформация белковой молекулы, вследствие чего нарушается пространственное соответствие активного центра и субстрата, а значит, скорость реакции снижается.
5. Возможность насыщения фермента субстратом (особенности кинетики).
6. Ферментативный катализ – это строго запрограммированный процесс (1 реакция; 1 субстрат; 1 фермент) – серия элементарных превращений вещества, строго организованных в пространстве и времени.
2. Механизм действия ферментов
Действие фермента основано на образовании фермент-субстратного комплекса. Под действием субстрата изменяется конформация фермента, затем изменяется субстрат.
Механизм действия ферментов можно представить в виде следующей схемы:
E+S → ES → EZ → EP → E+P
Можно выделить 4 фазы:
1. Между субстратом и ферментом возникают соединения (ES), в которых соединения связаны ионной, ковалентной или другой связью.
2. Субстрат под действием присоединенного фермента претерпевает изменения (S→Z), делающие его более доступным для соответствующей реакции.
3. Происходит химическая реакция с образованием фермент-продуктного комплекса (EP).
4. Продукты реакции высвобождаются из фермент-продуктного комплекса.
3. Номенклатура и классификация ферментов
Номенклатура ферментов (правила образования их названий)
1. Случайная (по случайным признакам) – тривиальная
Пример: папаин (carica papaja – из дерева).
2. Рациональная: субстрат +”аза” (липиды – липаза)
3. Систематическая: субстрат + тип катализируемой реакции + «аза» (лактатдегидрогеназа), либо субстрат + название класса, к которому относится данный фермент+ «аза» (лактат-оксидоредуктаза).
Классификация ферментов
Принята в 1961 году.
В основу классификации положен тип катализируемой реакции:
1. Оксидоредуктазы (сложные ферменты, катализирующие окислительно-восстановительные реакции). Пример: изоцитратдегидрогеназа из цикла Кребса.
2. Трансферазы (катализируют реакции переноса функциональных групп или молекулярных остатков между молекулами). Пример: киназы – трансферазы 1-й стадии гликолиза.
3. Гидролазы (простые ферменты, катализируют реакции гидролиза крахмала, олигосахаридов, жиров). Примеры: липаза, инвертаза, мальтаза и др.
4. Лиазы (катализируют негидролитическое отщепление от субстратов определенных групп атомов с образованием двойной связи, либо присоединением по двойной связи). Пример: альдолаза из гликолиза.
5. Изомеразы (катализируют реакции изомеризации – пространственной или структурной перестройки в пределах 1-й молекулы). Пример: триозофосфатизомераза из гликолиза.
6. Лигазы (часто называются синтетазами) – катализируют реакции синтеза, сопряженные с распадом богатых энергией связей (АТФ).
Каждый фермент имеет 4-х-значный шифр: класс-подкласс-подподкласс- индивидуальный номер фермента.
4. Кинетика ферментативных реакций
Особенностью кинетики ферментативной реакции является насыщение фермента субстратом, при котором дальнейшее увеличение [S] не приводит к увеличению скорости реакции. Эмпирическим путем установлено, что кинетика ферментативной реакции может быть выражена следующим графиком:
Концентрация субстрата, при которой фермент достигает насыщения, является постоянной характеристикой для каждого конкретного фермента.
Кинетику ферментативной реакции можно описать с помощью уравнения, которое было выведено теоретическим путем учеными Михаэлисом и Ментен, и именно в честь них было названо.
Уравнение Михаэлиса - Ментен
К м – константа Михаэлиса. Это такая концентрация субстрата, при которой скорость реакции равна половине максимальной.
Константа Михаэлиса характеризует сродство фермента к субстрату: чем меньше эта константа, тем больше сродство фермента к субстрату, тем эффективнее реакция.
5. Регуляция ферментативных процессов в клетке
Многочисленные способы регуляции ферментативных процессов можно разделить на две группы:
1. Регуляция содержания фермента за счет изменения скорости его синтеза и распада. Следует отметить следующие процессы:
репрессия – процесс подавления (или снижения) скорости синтеза фермента;
индукция – процесс ускорения синтеза ферментов под действием специфических низкомолекулярных соединений – индукторов.
2. Регуляция активности имеющихся в клетке ферментов.
а) путем изменения температуры, значения рН, количества субстрата, кофакторов и т.д.;
б) аллостерическая регуляция (характерна только для аллостерических ферментов). Аллостерическими называют ферменты, имеющие кроме активного центра дополнительный центр связывания (аллостерический центр). Активность аллостерических ферментов регулируется путем изменения конформации молекул ферментов, вызванного присоединением специального метаболита к аллостерическому центу. Метаболит-регулятор (аллостерический эффектор) выполняет функции либо активатора, либо ингибитора;
в) ковалентная модификация ферментов – регуляция каталитической активности ферментов может осуществляться за счет ковалентного присоединения фосфатной группы или нуклеотида. Например, фосфорилированная форма гликогенфосфорилазы обладает более высокой каталитической активностью;
г) изменение активности ферментов с помощью активаторов – химических соединений, повышающих активность ферментов (например, аминокислота цистеин и трипептид глутатион активируют действие многих протеаз).
д) изменение активности ферментов с помощью ингибиторов – химических соединений, подавляющих активность ферментов.
Ингибирование
Ингибирование – снижение или полное подавление активности ферментов под действием определенных веществ (ингибиторов).
Ингибирование может быть двух основных видов: небратимое и обратимое.
При необратимом ингибировании фермент и ингибитор образуют недиссоциирующий комплекс. Необратимое ингибирование в организме встречается редко и если оно есть, то из-за веществ, поступающих извне.
При обратимом ингибировании фермент и ингибитор образуют диссоциирующий комплекс.
Обратимое ингибирование, в свою очередь, делится на конкурентное и неконкурентное.
Конкурентное ингибирование – ингибирование, при котором субстрат и ингибитор обладают сходным строением и конкурируют за активный цент фермента. Конкурентное ингибирование в организме часто встречается и является способом регулирования активности фермента.
Скорость реакции при конкурентном ингибировании зависит от соотношения концентраций субстрата и ингибитора. Чем выше концентрация субстрата, тем выше вероятность формирования комплекса, тем выше скорость реакции. Таким образом, конкурентное ингибирование можно подавить путем увеличения концентрации субстрата.
Неконкурентное ингибирование – ингибирование, при котором субстрат и ингибитор взаимодействуют с разными частями молекулы фермента. При этом ингибитор, соединяясь с молекулой фермента, так модифицирует его структуру, что достижение максимальной скорости реакции невозможно.
При неконкурентном ингибировании увеличение концентрации субстрата не приводит к устранению действия ингибитора. Неконкурентное ингибирование в организме, как правило, связано с поступлением в организм тяжелых металлов.
Раздел 5. УГЛЕВОДЫ И ИХ ОБМЕН
Лекция 6. Химическое строение и свойства углеводов
1. Общая характеристика и классификация углеводов
К углеводам относятся соединения, обладающие разнообразными и часто совершенно противоположными свойствами. Среди них есть вещества низкомолекулярные и высокомолекулярные, кристаллические и аморфные, хорошо растворимые в воде и совершенно в ней нерастворимые, способные окисляться и сравнительно устойчивые к действию окислителей.
Общая формула, характерная для подавляющего числа углеводов, С n (Н 2 О) m
По химической природе углеводы делятся на:
· моносахариды (простые сахара);
· олигосахариды;
· полисахариды.
Моносахариды содержат 3-8 атомов углерода и не подвергаются гидролизу с образованием простых углеводородов.
Олигосахариды – полимеры моносахаридов, которые содержат 2-10 остатка моносахаров.
Полисахариды – полимеры моносахаридов, которые содержат более 10 остатков моносахаров.
2. Строение, свойства и функции моносахаридов
Моносахариды делятся на следующие группы:
1. По количеству атомов углерода:
· Триозы (3)
· Тетрозы (4)
· Пентозы (5)
· Гексозы (6)
· Гептозы (7)
· Октозы (8)
2. По химическому строению:
· Альдозы
Все моносахариды являются спиртами, либо альдегидоспиртами, либо кетоспиртами. В их молекулах, как правило, количество атомов углерода равно количеству молекул воды (т.е. m = n).
D-глюкоза (альдоза) D-фруктоза (кетоза)
Альдозы и кетозы являются изомерами.
Основные химические свойства моносахаридов:
1.Мутаротация – переход аномера из одной формы в другую (например, α-глюкоза →β-глюкоза). Аномерами называют энантиомерные формы моносахаридов, различающиеся положением полуацетального гидроксила.
2. Восстановление до многоатомных спиртов (например, глюкоза восстанавливается до сорбита, рибоза – до рибита).
3. Окисление с образованием соответствующих кислот (например, в зависимости от окисляемой группы глюкоза может образовывать глюконовую, глюкуроновую и глюкаровую кислоты).
4. Эпимеризация (например, в слабощелочной среде D-глюкоза находится в равновесии с кетогексозой (D-фруктозой) и альдогексозой (D-маннозой).
5. Образование гликозидов. Конденсация аномерной ОН-группы со спиртовой группировкой молекулы приводит к образованию О-гликозидов. Именно за счет этих связей построены олиго- и полисахариды. При взаимодействии аномерной ОН-группы с NH 2 -группой образуются N-гликозиды.
6. Этерификация. Гидроксильные группы моносахаридов образуют эфиры с различными кислотами. В метаболизме особо важную роль играет фосфорилирование сахаров.
7. Способность реагировать с азотсодержащими соединениями при высокой температуре с образованием специфических окрашенных веществ – меланоидинов.
8. Способность глюкозы (и других гексоз) подвергаться расщеплению (путем гликолиза) и сбраживанию микроорганизмами.
Основные функции моносахаридов:
1. Энергетическая (моносахариды легко расщепляются с выделением энергии, которая затрачивается на образование АТФ).
2. Пластическая (метаболическая). Моносахариды являются предшественниками для образования многих важных веществ: резервных и структурных полисахаридов, аминокислот, жирных кислот, глицерина и др.
3. Строение, свойства и функции олигосахаридов
Олигосахариды различаются по следующим показателям:
1. Количество моносахаридов.
2. Качественный состав.
3. Характер гликозидной связи между моносахаридами.
В растворах моносахариды всегда присутствуют в циклической форме; в состав олиго- и полисахаридов они также входят в циклической форме.
Первый углеродный атом, соединенный с кислородом, является наиболее реакционноспособным. Как правило, связь образуется за счет гликозидного (полуацетального) гидроксила.
Для олигосахаридов характерны некоторые свойства, отмеченные для моносахаридов. Следует также отметить, что олигосахариды, поступающие в организм человека с пищей, в желудочно-кишечном тракте подвергаются гидролизу до своих структурных блоков – моносахаридов. Поэтому в клетки они попадают уже в виде простых сахаров и, соответственно, выполняют те же функции, что и моносахариды.
Из олигосахаридов наибольшее распространение получили дисахариды. Рассмотрим химический состав наиболее важных из них.
Сахароза состоит из остатков α-глюкозы и β-фруктозы, соединенных β-гликозидной (или фруктозидной) связью. Гидролиз сахарозы происходит при участии фермента инвертазы (сахаразы):
сахароза α-глюкоза β-фруктоза
Инвертаза в больших количествах содержится в дрожжах и в кишечнике организмов. Смесь глюкозы и фруктозы в равных количествах, которая образуется при гидролизе сахарозы, называется инвертным сахаром.
Мальтоза – дисахарид, состоящий из 2-х остатков α-глюкозы. Это основной продукт гидролиза крахмала.
Мальтоза → α-глюкоза + α-глюкоза
Гидролиз мальтозы проходит при участии фермента мальтазы.
Мальтаза есть в слюне и поджелудочном соке.
Лактоза – молочный сахар, образуется в организме животных.
Лактоза = β-галактоза + α-глюкоза.Гидролиз лактозы катализируется ферментом лактазой.
Лактаза очень активна у младенцев; у некоторых взрослых лактаза не сохраняется, что влечет за собой непереносимость молока.
4. Строение, свойства и функции полисахаридов
Полисахариды подразделяются на гомосахариды и гетеросахариды.
В состав гомосахаридов входят моносахариды одного типа. Если мономер–фруктоза, то полисахарид нзывается фруктан; галактоза – галактан; глюкоза – глюкан.
Мономерами гетерополисахаридов являются моносахариды 2-х или нескольких типов. К примеру, арабиноза и глюкоза входят в состав арабиноглюканов; арабиноза и ксилоза – арабиноксиланов.
Крахмал (гомосахарид) – запасной полисахарид растений; существует в 2-х формах: амилоза и амилопектин.
Амилоза – линейный полисахарид, состоит из остатков α-глюкозы, соединенных α –1, 4 связью.
Амилопектин – разветвленный полисахарид, в котором на каждые 12 остатков глюкозы, соединенных α –1, 4 связью, приходится α –1, 6 связь.
Эти вещества сильно различаются по своим физическим и химическим свойствам. Так, например, от йода амилоза окрашивается в синий цвет, а амилопектин – в красно-фиолетовый. Они различаются и по растворимости: амилоза легко растворяется в теплой воде и дает растворы со сравнительно невысокой вязкостью, в то время как амилопектин растворяется в воде лишь при нагревании под давлением и дает очень вязкие растворы.
Гликоген («животный крахмал») – по строению сходен с крахмалом, но характеризуется большей разветвленностью.
Является резервным питательным веществом (образуется главным образом в печени и мышцах).
Целлюлоза (клетчатка) – полисахарид, состоящий из большого количества остатков β-глюкопиранозы.
Функции полисахаридов:
1. Запас питательных веществ (крахмал, гликоген – наиболее распространенные вещества).
2. Источники энергии (при использовании их в качестве источников энергии они должны сначала подвергаться расщеплению до моносахаридов).
3. Структурная (целлюлоза – образует клеточные стенки у растений, хитин – у животных, муреин – у бактерий).
После экстракции смеси белков из биологического материала проводят ее разделение на индивидуальные фракции белков. Разработано несколько методов фракционирования белков, основанных на различных физико-химических свойствах белков.
– осаждение белков в изоэлектрической точке – в основе метода лежит свойство белков в изоэлектрической точке выпадать в осадок вследствие нейтрализации заряда белковой молекулы. Для каждого белка значение изоэлектрической точки строго индивидуально, поэтому данным методом возможно выделение индивидуальных белков (подробнее о методе см. лабораторную работу №3 в курсе «Биохимия»).
– фракционирование белков методом высаливания – основано на различной растворимости белков в концентрированных растворах нейтральных солей, в зависимости от молекулярной массы (подробнее о методе см. лабораторную работу №3 в курсе «Биохимия»).
– метод электрофоретического разделения белков на фракции – описан в разделе физико-химические свойства белков.
Кроме представленных выше методов для разделения белков на фракции широко используют хроматографические методы . Чаще всего используют колоночную хроматографию.
Особенностью данного метода является то, что смесь молекул различных белков и пептидов пропускают через колонку, содержащую твердый пористый материал (матрикс). В результате взаимодействия с матриксом различные белки проходят через колонку с различной скоростью. После того как белки достигнут в определенной последовательности дна колонки, их собирают отдельными фракциями в пробирки.
Выделяют три основных вида колоночной хроматографии:
– ионообменная – для хроматографии белков применяют ионообменники на основе целлюлозы или других гидрофильных полимеров, например, диэтиламиноэтилцеллюлозу (ДЭАЭ-целлюлоза), содержащую катионные группы (отрицательный заряд) или содержащую карбоксиметилцеллюлозу (КМ-целлюлоза), содержащую аминные группы (положительный заряд):
Прочность связывания белков с ДЭАЭ-целлюлозой тем выше, чем больше в молекуле белка карбоксильных групп. Белки, адсорбированные на ДЭАЭ-целлюлозе, можно смыть (элюировать) из колонки растворами с возрастающей концентрацией хлорида натрия. Вначале элюируются слабосвязанные белки, а по мере увеличения концентрации соли и другие белки, в порядке возрастания их сродства к ДЭАЭ-целлюлозе.
Аналогично применяют и КМ-целлюлозу, но сродство белков к ней прямо пропорционально числу аминогрупп в молекуле белка.
Для снятия связанного белка также изменяют рН элюента.
– хроматография гель-фильтрацией – имеет второе название «метод молекулярных сит». В качестве сит используют сефадекс (полисахарид декстран, обработанный эпихлоридгидрином). Зерна сефадекса набухают в воде и образуют гель. Набухшие гранулы имеют поры определенного диаметра.
Разделение основано на том, что зерна сефадекса (поры гранул) непроницаемы или ограничено проницаемы для веществ с большой молекулярной массой, а небольшие молекулы свободно диффундируют (проникают) в поры зерен.
Гелеобразную массу набухшего сефадекса помещают в стеклянную колонку (трубку), на поверхности геля наносят слой белкового раствора (рис. 12, а) и затем через колонку пропускают буферный раствор (элюирующая жидкость). Белки проходят вдоль колонки между гранулами тем медленнее, чем меньше их молекулярная масса, так как молекулы белков с еще меньшей молекулярной массой легче диффундируют внутрь гранул (в поры) (рис. 12).
Рис. 12. Фракционирование белков методом гель-фильтрации
Белки вымываются (элюируются) из колонки в порядке убывания молекулярной массы. Следовательно, первыми элюируются крупные белковые молекулы (рис. 12, б), которые не диффундируют в зерна, затем мелкие молекулы и в последнюю очередь низкомолекулярные примеси.
Этот метод применяют не только для фракционирования белков по молекулярной массе, но и для очистки их от низкомолекулярных примесей.
– аффинная хроматография – или хроматография по сродству. Принцип метода заключается в том, что происходит избирательное взаимодействие белков со специфическими веществами – лигандами, закрепленными на носителях (рис. 13).
В качестве носителя используют активированную бромцианом сефарозу. К сефарозе присоединяют лиганды различного происхождения – субстрат, или антиген, или рецептор, которые будут афинно связывать только один белок из смеси:
– субстрат → фермент;
– антиген → антитело;
– гормон → рецептор данного гормона.
Другие белки, не связавшиеся с лигандом, удаляются путем промывания колонки.
Рис. 13. Механизм аффинной хроматографии
Снятие с колонки афинно закрепленного белка осуществляется с помощью буферного раствора (элюента). В состав буфера вводят детергент, который ослабляет связи между белком и лигандом, или через колонку пропускают раствор с высокой концентрацией свободного лиганда. В этом случае белок легче связывается со свободным лигандом и вымывается (элюируется) из колонки.
Заголовок
2
2
Выделение и очистка белков осуществляется поэтапно.
1. Гомогенизация
– это тщательное измельчение объектов биохимического исследования до однородного, то есть гомогенного состояния, то есть белки подвергаются тщательной дезинтеграции вплоть до разрушения клеточной стенки.
При этом используют:
а)
ножевые гомогенизаторы типа Уорринга;
б)
пестиковые гомогенизаторы Поттера - Эльвегейма;
в)
шаровые и валковые мельницы – для более плотных объектов;
г)
метод попеременного замораживания и оттаивания, при этом разрыв клеточной стенки происходит под действием кристалликов льда;
д)
метод «азотной бомбы» – под высоким давлением клетки насыщаются азотом, затем давление резко сбрасывают, выделяется газообразный азот, который как бы взрывает клетку изнутри;
е)
УЗ, различные пресс - методы, переваривание клеточных стенок ферментами. В большинстве случаев при гомогенизации выделяется тепло, при этом многие белки могут инактивироваться, поэтому все процедуры проводятся в холодных помещениях при t 0 или охлаждают сырье с помощью льда. При этом тщательно контролируют объем и время разрушения клеток, рабочее давление. Идеальным считается такой гомогенизат, который может подвергнуться дальнейшему экстрагированию.
2. Экстракция белков , то есть их перевод в растворенное состояние; чаще всего экстракцию проводят вместе с измельчением одновременно.
Экстракцию проводят:
а)
растворением в 8-10% растворах солей;
б)
с использованием буферных растворов с рН от кислых до слабощелочных (боратных, фосфатных, цитратных, трис - буферных: смесь трисаминометана с NH2 – CH3 + HCl;
в)
осаждение белков органическими растворителями (этанол, метанол, бутанол, ацетон и их комбинациями), при этом происходит расщепление белково-липидных и белково-белковых компонентов, то есть разрушение ЧСБ.
3. Очистка и фракционирование белков. После экстрагирования производят разделение или фракционирование смеси на индивидуальные белки и их дальнейшую очистку:
а) высаливание – это процесс осаждения белков нейтральными солевыми растворами щелочных и щелочноземельных металлов.
Механизм высаливания – добавляемые анионы и катионы разрушают гидратную белковую оболочку белков, являющуюся одним из факторов устойчивости белковых растворов. Чаще всего применяются растворы сульфатов Na и аммония. Многие белки отличаются по размеру гидратной оболочки и величине заряда. Для каждого белка есть своя зона высаливания. После удаления высаливающего агента белок сохраняет свою биологическую активность и физико-химические свойства. В клинической практике применяется метод высаливания для разделения глобулинов (при добавлении 50% раствора сульфата аммония (NH 4)2SO 4 выпадает осадок) и альбуминов (при добавлении 100% раствора сульфата аммония (NH 4)2SO 4 выпадает осадок).
На величину высаливания оказывают влияние:
1) природа и концентрация соли;
2) рН-среды;
3) температура.
Главную роль при этом играют валентности ионов. Поэтому действие соли оценивают по ионной силе раствора μ:
, то есть ионная сила раствора (μ) равна произведению ½ концентрации каждого иона (С) на квадрат его валентности (V).
Метод Кона является разновидностью высаливания. Одновременно происходит экстракция и осаждения компонентов. Изменяя последовательно температуру (обычно низкие t o –0+8 o С), рН раствора и концентрированного этанола, из плазмы крови последовательно выделяют до 18 фракций белков.
Метод Кона
применяют в фармацевтическом производстве при получении кровезаменителей;
б) методы хроматографии
. Основоположником разработки хроматографических методов анализа считается русский ученый Михаил Цвет (1903). В настоящее время существует много ее разновидностей. В основе метода лежит способность веществ специфически адсорбироваться на адсорбенте, заключенном в колонку или помещенном на каком-либо носителе. При этом происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают соответствующие элюенты (растворители), которые ослабляют силы адсорбции и вымывают адсорбированные вещества из колонки. Вещества собираются в коллекторе фракций.
Основополагающим в хроматографии является коэффициент распределения , который равен отношению концентрации вещества в подвижной фазе к концентрации вещества в неподвижной фазе (или стационарной фазе ).
Неподвижная стационарная фаза – может быть твердой или жидкой или смесью твердой и жидкой.
Подвижная фаза – жидкая или газообразная, она течет по стационарной, или пропускается через нее.
В зависимости от вида стационарной и подвижной фазы бывают различные модификации хроматографического анализа.
Адсорбционная – основана на различной степени адсорбции белков адсорбентом и растворимости их в соответствующем растворителе.
Применяемые адсорбенты – кремниевая кислота, Al 2 О 3 , CaCO 3 , MgO, древесный уголь. Адсорбент в виде суспензии с растворителем (чаще с буферным раствором) упаковывают в колонке (стеклянная вертикальная трубка). Образец наносят на колонку, затем через нее пропускают растворитель или смесь растворителей.
Разделение основано на том, что вещества с более высоким К распр. (Б), продвигаются по колонке с большей скоростью. Сбор фракций осуществляется с помощью коллектора фракций.
Распределительная хроматография
– основана на распределении смеси белков между двумя жидкими фазами. Разделение может происходить на специальной хроматографической бумаге, а также в колонках, как в адсорбционной. Твердая фаза в данном случае служит только опорой для жидкой стационарной фазы. Хроматографическая бумага обладает свойством задерживать воду между своими целлюлозными волокнами. Эта вода - неподвижная стационарная фаза. Когда по бумаге под действием капиллярных сил движется неводный растворитель (подвижная фаза), молекулы вещества, нанесенного на бумагу, распределяются между двумя фазами в соответствии с их коэффициентом распределения. Чем выше растворимость вещества в подвижной фазе, тем дальше оно продвинется по бумаге вместе с растворителем.
В случае распределения хроматографии на колонке – носители – это целлюлоза, крахмал, силикагель и др., неподвижная фаза – вода. При нанесении на колонку вещества смеси движутся по колонке с разной скоростью с учетом Краспр.
Rf для каждого соединения в стандартных условиях величина постоянная.
Ионообменная хроматография – основана на притяжении противоположно заряженных частиц. Для этого используют различные ионообменные смолы: катионообменные – содержат отрицательно заряженные группы – сульфированные стиролы и КМЦ, которые притягивают положительно заряженные ионы исследуемых веществ. Их называют также кислотными ионообменниками.
Анионообменные смолы, или основные ионообменники, содержат положительно заряженные группы, притягивающие отрицательно заряженные молекулы белков
Триметиламиностирол, это производное стиролов и целлюлозы.
В зависимости от q разделяемых белков используют соответствующие ионообменники, с которыми взаимодействуют определенные белки, а другие беспрепятственно выходят из колонки. «Осажденные» на колонке белки снимают, используя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента.
Аффинная хроматография (или хроматография по сродству) основана на принципе избирательного взаимодействия белков или других макромолекул с иммобилизованными на носителях специфическими веществами – лигандами (это может быть кофермент, если выделяют фермент, антитело антиген и др. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованным лигандам к нему присоединяется только один белок из смеси. Смывается буферными смесями с измененным рН или измененной ионной силой.
Достоинство – возможность одноэтапно выделить заданное вещество высокой степени чистоты.
Метод гель - фильтрации или метод молекулярных «сит» - это разновидность проникающей хроматографии.
Разделение молекул по размерам и форме основано на свойствах молекулярного сита, которые обладают многие пористые материалы, например органические полимеры с трехмерной сетчатой структурой, придающей им свойства гелей. Гель фильтрация – это разделение веществ с помощью гелей, основанное на различиях в размере молекул (сефароза, сефадекс, сефакрил, биогели и т.д.). Под действием эпихлоргидрина полисахаридные цепочки декстрана (синтезируется микроорганизмами) сшиваются в сетчатую структуру, становятся нерастворимыми в воде, но сохраняют к ней большое сродство. Благодаря этой гидрофильности полученные зерна (называемые сефадексом) сильно набухают с образованием геля, которым заполняют колонку. Метод основан на том, что крупные молекулы не проникают во внутреннюю водную фазу, а более мелкие молекулы сперва проникают в поры «сита», как бы застревают в них, а поэтому движутся с меньшей скоростью. Соответственно белки с большей Mr первыми поступают в приемник. В последнее время в проникающей хроматографии все чаще используют в качестве молекулярного сита пористые стеклянные гранулы.
Электрофоретический метод в биохимии – основан на различии скорости передвижения молекул в электрическом поле (аминокислоты, пептиды, белки, нуклеиновые кислоты).
Различие скорости движения зависит:
1. от q молекулы: подвижность молекул тем больше, чем больше суммарный q. Величина q зависит от рН;
2. от размеров молекул: чем крупнее молекулы, тем меньше их подвижность. Это связано с возрастанием сил трения и электростатических взаимодействий крупных молекул с окружающей средой;
3. от формы молекул: молекулы одинакового размера, но различной формы, например, фибрилл и глобул белка обладают различной скоростью. Это связано с различиями в силах трения и электростатического взаимодействия.
Виды электрофореза
а) Изоэлектрическое фокусирование. Разделение происходит на вертикальной колонке в град. как рН, так и напряжения. С помощью специальных носителей амфолитов в колонке устанавливается град. рН от 0 до 14. В колонку помещают смесь веществ, подключаю электроток. Каждый из компонентов движется к той части колонки, где значение рН соответствует его изоэлектрической точке и там останавливается, то есть фокусируется.
Достоинство: происходит разделение, очистка и идентификация белков в один прием. У метода высокая разрешительная способность (0,02 pI).
б) Изотахофорез – это электрофорез на поддерживающих средах. После включения электротока ионы с самой высокой подвижностью движутся к соответствующему электроду первыми, с самой низкой – последними, обладающие промежуточной подвижностью – располагаются посередине.
в) Диск-электрофорез – прибор состоит из двух сосудов с буфером – верхнего и нижнего, соединенных вертикальными трубками, содержащими разнопористый гель. По мере движения ионизированных частиц под действием электротока. Более высокая пористость – в верхней части геля.
г) Иммуноэлектрофорез – метод сочетающий электрофорез с иммунодиффузией (для обнаружения антигенов в сложных физиологических смесях). На специальный носитель перпендикулярно друг другу помещают смесь антигенов и смесь антител. При включении электротока они разделяются на индивидуальные вещества и диффундируют на гелевом носителе. В месте встречи антигена с соответствующим антителом происходит специфическая реакция преципитации в форме дуги. Количеств образовавшихся дуг соответствует количеству антигенов.
Методы определения Mr белков
У большого числа белков химический состав и последовательность аминокислот не установлена (1010–1012 белков), поэтому у таких белков определяют Mr. При этом используются различные методы.
а) Седиментационный метод – определение Mr проводят в специальных центрифугах (первая центрифуга была предложена шведским биохимиком Сведбергом), в которых удается создать центробежное ускорение, которое больше в 200 тыс. и более раз ускорения земного притяжения. Mr определяют по V седиментации молекул. По мере перемещения молекул от центра к периферии образуется резкая граница белок-растворитель. Скорость седиментации выражают через константу седиментации (S):
где V – скорость перемещения границы белок-растворитель (см/с);
– угловая скорость ротора (рад/с);
– расстояние от центра ротора до середины ячейки с раствором белков (см).
Величина константы седиментации S, которая равна 110–13 С условно принята за 1 и называется 1 Сведбергом (S). S для белков лежит в пределах 1-50 S, иногда до 100 S.
Mr белков определяется по уравнению Сведберга:
где R – универсальная газовая постоянная;
Т – абсолютная температура по Кельвину;
S – константа седиментации;
Д – коэффициент диффузии;
– плотность растворителя;
V – парциальный удельный объем газа.
Этот метод дорогостоящий из-за применения аппаратуры.
Более просты и дешевы:
б) Гель-фильтрация в тонком слое сефадекса.
Длина пробега белка (в мм) находится в логарифмической зависимости от Mr.
Х – Mr искомого белка на калибровочном графике.
в) Диск-электрофорез в полиакриламидном слое – также существует зависимость между логарифмом Mr калибровочных белков и длиной их пробега.
Методы определения гомогенности белков
Степень чистоты выделенного белка определяется:
- ультрацентрифугированием;
- методом диск - электрофореза;
- различными иммунохимическими методами;
- определением растворимости белка (метод Нортропа) основан на правиле фаз, согласно которому растворимость чистого вещества при данных условиях опыта зависит только от температуры, но не зависит от концентрации вещества в твердой фазе.
Если белок гомогенный, то на графике получается один перегиб (а), если есть примеси белков (б, в), то получим несколько перегибов кривой насыщения. У всех белков свои индивидуальные кривые растворимости.